左旋肉碱体外培养中提高睾丸精子活率的实验研究

王怀秀， 李先莲， 袁彩霞， 宋玉梅， 曹莹丽， 董丽娜， 秦琴   

                   ( 山西省人民医院 生殖医学科，太原 030012 ) 北京家圆医院生殖中心王怀秀

自 1978 年第一例试管婴儿出生以来，不育症，尤其是排卵障碍与卵子输送障碍所致不育症的治疗获得突破。自 1992 年卵子胞浆内单精子显微注射（ ICSI ）技术问世以来，即使精液中无精子的患者也有望利用睾丸、附睾中的精子进行 ICSI 获得生育。但是，睾丸中的精子不能运动，难以判断其是否为活精子，需要体外培养一段时间部分活精子才能获得一定运动能力。为了提高睾丸精子的活率，便于选择用于 ICSI 的精子，本文尝试对睾丸精子用含左旋肉碱培养液进行培养，并对其提高精子活力的效果进行评价。

              材料与方法

一、材料

    1.试剂：  左旋肉碱和矿物油（Sigma，美国）。 ART1020 受精培养液及含 Hepes 缓冲剂的培养基 ART1023 （Sage，美国）。

    2.标本来源：  从2011 年 5 月至 201 年 10 月， 对 10 例无精子症不育症患者进行睾丸活检，对送活检剩余睾丸组织在不同浓度乙酰肉碱培养液中进行体外培养，观察不同浓度乙酰肉碱对睾丸精子活力的影响。 10 例患者睾丸体积 13 ~15ml ， 生殖器官发育及卵泡刺激素、黄体生成素、雌激素、孕激素、催乳素及睾酮测定正常。其中1 例 输精管触诊未及输精管，超声检查未及精囊，结合精液检查精液量少、pH 偏低以及中性 α糖苷酶低于正常诊断为输精管、精囊缺如。另9 例 体检 附睾可及硬结，中性α糖苷酶低于正常，诊断为梗阻性无精子症。该课题经过医院伦理委员会审查通过。

方法

    1.左旋肉碱液配制：用 ART1020 液溶解左旋肉碱，配制成含 左旋肉碱 0mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml ， 10mg/ml ， 15mg/ml 的培养液， 0.22 μm 针头过滤器过滤备用。

    2.睾丸活检：常规消毒术野后，铺无菌孔巾，用 2% 利多卡因在与睾丸中部相应阴囊处进行局部浸润 麻醉 。切开阴囊皮肤后，钝性分离组织至睾丸白膜。切开白膜，将挤出切口的 生精小管切下，部分送组织学检查，部分进行左旋肉碱试验。取活检后，常规缝合白膜、阴囊皮下组织以及阴囊皮肤。用创可贴贴敷伤口。

    3.左旋肉碱试验： 将取得的睾丸组织浸泡于经过平衡的 ART1023 培养液中，用注射器针头撕扯曲细精管并换液 2 次清洗，去除组织中的血细胞。用注射器针头将曲细精管撕碎， 2000r/min 离心 10 min，去上清，将细胞团用 0.3ml ART1023液体混匀。在经 32 。C,5%CO2平衡1d，含左旋肉碱 0mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml ， 10mg/ml ， 15mg/ml 的 ART1020 液滴（每液滴 1.0ml) 中分别加入 0.1ml 细胞悬液。置培养箱内（ 32 。C,5%CO2）培养 4 h，然后在显微镜下观察精子活动情况。每个液滴计数 100 条精子，并计算出活动精子及非活动精子比例。

三、统计学分析

应用 SPSS11. 5 统计学软件包对数据进行分析处理 ,  因 5 组资料方差不齐，采用 Kruskal-Wallis Test 进行多样本比较，并用 Mann-Whitney Test 进行两样本比较。 P<0.05 为有统计学意义 。

                       结  果

第一批 3 例患者，在培养 4 h后所有培养皿内精子均不活动。培养 24 h观察，左旋肉碱 15mg/ml,10mg/ml 培养皿内生精细胞及其他细胞颜色变暗，左旋肉碱 0mg/ml,0.1mg/ml 培养皿内细胞颜色基本正常。仔细观察发现，左旋肉碱 15mg/ml,10mg/ml 培养皿内培养液呈黄色，提示培养液呈强酸性，分析细胞颜色变暗可能与培养液 pH 异常有关。在以后的试验中，先将含左旋肉碱培养液 pH 调节为中性。 7 例患者不同左旋肉碱浓度培养液 对睾丸精子活率（a 、 b 、 c 级精子） 及活力（ a 、 b 级精子） 的影响结果如下：

表1  不同浓度左旋肉碱体外培养对精子活率及精子活动度的影响（ X+S ）

左旋肉碱浓度	n	精子活率（% ）	精子活力（a+b)(%)
0	7	0.00+0.00	0.00+0.00
0.1	7	2.57+4.54	0.57+1.13
1	7	7.42+9.83*	1.86+2.48
10	7	17.43+9.43**♦♦	4.57+2.82 ※※ ★★
15	7	9.86+6.01**♦	2.00+1.41 ※※ ★

注： 对 5 组资料 精子活率进行多样本秩和检验， p=0.001, 具有显著性差异。 与未添加左旋肉碱组精子活率比较， *p<0.05,**p<0.01; 与添加 0.1mg/ml 左旋肉碱组精子活率比较， ♦p<0.05,♦♦p<0.01 。 其他组两两比较 p>0.05 。虽然 10mg/ml ， 15mg/ml 两组无显著统计学差异，但可以看出，左旋肉碱 10mg/ml 组精子活率要高于 15mg/ml 组。

    对 5 组资料精子活力进行多样本秩和检验， p=0.01 ，具有显著性差异。与未添加左旋肉碱组精子活力比较， ※※ p<0.01, 与添加 0.1mg/ml 左旋肉碱组精子活力比较， ★p<0.05,★★p<0.01。其它组两两比较，p>0.05。虽然 10mg/ml ， 15mg/ml 两组无显著统计学差异，但可以看出，左旋肉碱 10mg/ml 组精子活力要高于 15mg/ml 组。

                       讨论

左旋肉碱是广泛存在于体内的一种水溶性非蛋白质氨基酸，在精子成熟过程中的几个方面均发挥重要作用。

首先，左旋肉碱是精子能量代谢的主要载体。它不但转运脂肪酸和磷脂进入精子线粒体内，也将脂肪酸转运至附睾上皮，再经附睾上皮转运至附睾管腔和精子。进入精子的脂肪酸首先活化生成脂酰辅酶 A ，在线粒体外膜肉碱酯酰转移酶 I 催化下与肉碱合成脂酰肉碱。后者在线粒体内膜肉碱—脂酰肉碱转位酶作用下，通过内膜进入线粒体基质内。进入线粒体内的脂酰肉碱在线粒体内膜内侧面的肉碱脂酰转移酶 II 的作用下转变为脂酰辅酶 A 并释放肉碱。脂酰辅酶 A 在线粒体基质中酶体系作用下进行 β氧化生成大量乙酰辅酶 A ，经三羧酸循环彻底氧化供能。肉碱则在肉碱—酯酰肉碱转位酶作用下转出线粒体内膜，与从线粒体内运出的乙酰基形成乙酰肉碱。附睾精子的乳酸脱氢酶 X 可利用乙酰左旋肉碱作为精子的另一能量来源  【1】。

其次，左旋肉碱有对抗活性氧损伤的作用。活性氧物质（ ROS ）是导致精子脱氧核糖核酸（ DNA ）线粒体损伤的重要来源，可引起睾丸内氧化和抗氧化系统平衡失调，从而影响精子功能。研究证明，左旋肉碱可对抗 ROS 引起的损伤，保护精子细胞膜和 DNA 【2】。当附属性腺发生炎症时，精浆中产生过多的 ROS ，可导致精子功能缺陷，降低自然妊娠率。用左旋肉碱和乙酰左旋肉碱治疗生殖道炎症的 男性不育 患者，可增加前向运动精子总数，降低精浆中 ROS 含量。其主要机制是通过将高浓度的乙酰辅酶 A 转运到精子外和 / 或将脂肪酸置换入精子内，使附睾内 ROS 的产生和清除恢复平衡 【1】。有研究表明【3】，脂多糖可以使大鼠谷胱甘肽和乳酸脱氢酶活性下降，丙二醛、一氧化氮和白介素 -2 上升，从而导致精子数量减少和精子活动力下降。左旋肉碱可以通过抗氧化以及抗炎机制逆转上述变化。

此外，左旋肉碱还有抗生精细胞及精子凋亡的作用。有人对大鼠睾丸进行 10Gy 的 γ照射，结果，受照射睾丸生精细胞出现脱落和排列紊乱，精子数量减少，精原细胞凋亡增加。但在γ照射后24小时给予左旋肉碱的大鼠，上述变化显著减轻，提示左旋肉碱有抗生精细胞凋亡的作用【4】。Yari 等【5】研究表明，给大鼠腹腔注射氯化镉后，附睾头部精子数量、活率以及生精小管内 Johnsen 评分明显下降，而在注射氯化镉前给予左旋肉碱的大鼠，附睾头部精子数量、活率以及生精小管内 Johnsen 评分明显上升。

在动物实验的基础上，唐凌峰等对男性精浆中左旋肉碱浓度进行分析。结果发现，精浆中左旋肉碱浓度与精子活率显著正相关【6】，证实了左旋肉碱对人类精子的作用。左旋肉碱和精子活率显著正相关，可能既有其参与精子能量代谢的作用，也有其抗氧化及抗凋亡的作用。

在认识到左旋肉碱的上述作用后，人们将其应用于 男性不育 的临床治疗。发现口服左旋肉碱可以明显提高精子密度以及精子活率【7】，，改善精子的受精率、优质胚胎率以及妊娠率【2】。

口服左旋肉碱可以提高精子活率，那么，对睾丸内精子进行体外培养时添加左旋肉碱是否可以提高精子活动能力呢？ Barihani  等 【8】对精液中精子离心洗涤后在左旋肉碱浓度分别为 0.1mg/ml,0.5mg/ml,1.0mg/ml,10mg/ml,50mg/ml 的培养液中进行体外培养，发现左旋肉碱浓度为 0.5mg/ml 培养液中精子活力明显提高，而 50mg/ml 培养液中精子活力反而被抑制。以上实验说明，体外培养中适宜浓度的左旋肉碱可以提高精子活力。

睾丸中精子不具有活动能力，如果能通过含左旋肉碱培养液培养使无精子症患者睾丸中精子活动起来，则有助于卵子胞浆内单精子显微注射技术对睾丸精子的选择。但是，对于睾丸内精子来说，左旋肉碱浓度多大为适宜呢？师娟子等【9】对梗阻性无精子症患者睾丸精子用左旋肉碱培养 24 ~72h，发现 6.45mg/ml 左旋肉碱培养液中精子活率明显高于 16.13mg/ml 左旋肉碱培养液。 RT-PCR 检测表明，前者可提高精子中Acr、P rm 1、Daz l及ATPase 6. 0基因的表达量, 而后者的Dazl、Acr、Prm 1基因的表达减少。

上述实验证明，左旋肉碱可使睾丸精子在体外培养中活率提高，但实验中左旋肉碱浓度只有6.45mg/ml 和 16.13mg/ml 两个等级。睾丸精子体外培养相对适宜的浓度是多少呢？左旋肉碱分子量为 161 ，人类血清中左旋肉碱浓度为 64.45 +10.06μmol/L，男性附睾中左旋肉碱浓度约为血清浓度的 1000 倍 [6]。按照以上数字计算，男性附睾液中左旋肉碱浓度应为 10.3mg/ml 左右。由于师娟子等的试验已经证明 6.45mg/ml 左旋肉碱培养液优于 16.13mg/ml 培养液，我们将试验中左旋肉碱浓度设计为 0mg/ml,0.1mg/ml,1mg/ml ， 10mg/ml ， 15mg/ml ，目的在于观察从 0mg/ml 到 15mg/ml 左旋肉碱对睾丸精子活率的影响。

在提高精子活力方面，除左旋肉碱外，人们还对己酮可可碱进行过研究。实验表明，己酮可可碱可以抑制磷酸二酯酶，提高环一磷酸腺苷水平，通过提高能量代谢在体外培养中提高精子活动能力。与己酮可可碱相比，左旋肉碱不仅可改善精子能量代谢，还可以对抗活性氧损伤和精子凋亡，是人体附睾中促使精子获得运动能力的正常成分。因此，本试验将左旋肉碱作为睾丸组织体外培养时的添加成分，观察其对睾丸组织中精子活动能力的影响。

在此次试验之前，我们曾对50例无精子症不育症患者睾丸组织进行体外培养。研究发现，刚刚取得的生精小管内精子均不活动，在经过大约2小时后，部分病例睾丸组织中精子开始出现原地运动。在经过4小时左右，运动精子数量渐渐增加。此外，在辅助生殖临床，一般在取卵后4~6h进行ICSI。如果能在取卵后4h左右从无精子症患者获得活动睾丸精子，则有利于生殖中心工作人员安排工作。因此，我们将观察精子活率的时间设计为培养后4h。

本研究表明，用10mg/ml左旋肉碱培养4h左右可以显著提高睾丸精子的活率。这一研究有以下意义：对梗阻性无精子症患者，有效方法为用睾丸中精子进行ICSI。但由于睾丸中精子不能活动，因此，让睾丸精子活动起来，从而判断精子是否有活力是ICSI技术中的一个重要环节。虽然用不含左旋肉碱的培养液进行培养液可以使睾丸精子活动起来，但活率较低。利用本研究成果，一方面，由于精子活率提高，有利于在ICSI前选择活动精子；另一方面，由于培养时间与取卵至ICSI时间段相近，方便体外受精实验室工作人员安排工作。但是，为了保证获得活动精子，最好在女方进入辅助生殖周期前，对男方进行睾丸活检并进行睾丸精子左旋肉碱培养。通过预先活检，一方面了解患者睾丸中有无精子，同时确认睾丸精子是否可通过左旋肉碱短时培养活动起来。

此外，对由于生精障碍导致的非梗阻性无精子症，只要不是没有生精细胞的唯支持细胞综合症等，有可能通过生精细胞培养让生精细胞分化为精子，实现精子“从无到有”或“从少到多”。然后再通过左旋肉碱培养，让培养所得的精子活动起来，实现“由静到动”。我们对生精阻滞患者的生精细胞进行培养，可以使精子数量显著增加。在通过生精细胞培养获得较多精子的基础上，进行左旋肉碱培养让精子活动起来。这样，由于生精障碍，原来睾丸中没有精子或精子很少的患者便有可能利用 ICSI 技术实现生育。

[参 考 文 献]

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[3]Abd-Allah AR, Hela GK, Al-Yahya AA,et al.  Pro-inflammatory and oxidative stress pathways which compromize sperm motility and survival may be altered by L-carnitine  [J].   Oxid Med Cell Longev , 2009,2(2)73-81

[4]Kanter M,Topcu-Tarladacalisir Y,Parlar S.  Antiapoptic effect of L-carnitine on testicular irradiation in rats  [J]. J of Mol Histol,  [J] 2010,41(2)121-128

[5]Yari A, Asadi MH,Bahadoran H, et al.  Cadmium toxicity in spermatogenesis and protective effects of L-carnitine in adult male rats [J]. Biol Trace Elem Res,  2010,137(2):216-25 

[6]唐凌峰，姜辉、商学军，等， 精浆左旋肉碱与精子密度、活力和活率关系的研究[J]. 中华男科学杂志， 2008，14（8）：704-708

[7]陈怀瑾，陈廷 左旋肉碱和乙酰左旋肉碱复合制剂对特发性弱精子症精子质量的影响 [J]. 中华男科学杂志， 2008，14（2）：149-151

[8]Banihani S,Sharma R,Bayachou M,et al.  Human sperm DNA oxidation ,motility and viability in the presence of L-carnitine during in vitro incubation and centrifugation [J]. Andrologia ,2011,43(1):1-8

9、师娟子，张珊珊，张洲,等. 梗阻性无精子症患者睾丸精子左旋肉碱培养后关键基因表达量的变化研究  [J]. 中华男科学杂志 ， 2010，16（6）：504-509